Молекулярно-генетические методы установления отцовтва

ЕСТЬ ВОПРОСЫ?
СПРОСИ У СПЕЦИАЛИСТА

Наша команда профессионалов ответит на ваши вопросы

Правила совпадения аллелей в генотипах родственников

Методика установления родства

Генетические маркеры, используемые для установления родства

Преимущества использования STR-локусов

Методы типирования STR-локусов

 

Правила совпадения аллелей в генотипах родственников

На основании изложенных выше сведений можно вывести следующие правила для генотипов родственных лиц по хромосомным локусам в случае отсутствия мутаций -
Для аутосом, вне зависимости от пола: в генотипе ребенка по любому локусу один из аллелей всегда совпадает с одним из аллелей в генотипе биологического отца по данному локусу, а другой аллель всегда совпадает с одним из аллелей в генотипе биологической матери по данному локусу.
Для Х-хромосом, ребенок женского пола: в генотипе ребенка по любому локусу X-хромосомы один из аллелей всегда совпадает с аллелем в генотипе биологического отца по данному локусу, а другой аллель всегда совпадает с одним из аллелей в генотипе биологической матери по данному локусу.
Для Х-хромосомы, ребенок мужского пола: в генотипе ребенка по любому локусу X-хромосомы аллель (он единственный, так как у мужчин, как уже упоминалось, в ядрах клеток в норме находится одна X-хромосома) всегда совпадает с одним из аллелей в генотипе биологической матери по данному локусу.
Для Y-хромосомы: генотип ребенка всегда совпадает с генотипом биологического отца.
Для митохондриальной ДНК, вне зависимости от пола: генотип (митотип) ребенка всегда совпадает с генотипом (митотипом) биологической матери.

Методика установления родства

   Генетический анализ родства основан на изложенных выше принципах и заключается в получения генотипов лиц, участвующих в исследовании и анализе полученных генотипов на предмет соответствия проверяемой степени родства. Нуклеотидная последовательность ДНК остается неизменной в течение всей жизни человека, поэтому генетический анализ родства может быть проведен в любое время, независимо от возраста исследуемых лиц. Суть методики генетического исследования биологического родства сводится к поиску и анализу совпадающих аллелей. Действительно, при различных степенях родства родственники либо должны иметь общие аллели во всех исследуемых локусах, либо вероятность обнаружения общих аллелей у родственников выше, чем у неродственных лиц. При выявлении противоречия с законами передачи наследственной информации делается вывод об исключении родства. Согласованность анализируемых генотипов и предполагаемого родства может быть обусловлена как истинным родством, так и случайностью. По этой причине в случае, когда генетические данные свидетельствуют в пользу родства, проводятся вероятностные расчеты для оценки достоверности полученного положительного заключения. Если уровень достоверности превышает требуемое минимальное значение, делается вывод об истинном родстве. Конечно, вероятность случайного совпадения генетических признаков для одного локуса сравнительно высока, однако современные системы, использующие десятки локусов, позволяют достигать уровня достоверности 99,99 % и выше.

Генетические маркеры, используемые для установления родства

   При установлении родства могут использоваться различные системы генетических маркеров. Главное, чтобы входящие в систему локусы были полиморфными, то есть имели несколько аллелей в популяции человека. Чем больше аллелей существует у данного локуса, тем меньше вероятность случайного совпадения аллелей у неродственных лиц и тем больше этот локус подходит для задач установления родства. В разное время для этих целей использовались системы основанные на:

  • группах крови (например, AB0); - полиморфизме различных структурных белков и ферментов;
  • полиморфизме антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA);
  • полиморфизме, обусловленном различием последовательностей аллелей локусов в один нуклеотид (SNP – Single Nucleotide Polymorphism);
  • полиморфизме длины специфических локусов, находящихся в некодирующих областях хромосом и представляющих собой цепочки повторяющихся блоков или «повторов», состоящих из одинаковых последовательностей нуклеотидов (например, STR-локусы, см. далее).

   Наиболее адекватным и информативным на сегодня является использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). При использовании данного метода число копий определенных участков молекулы ДНК увеличивается в сотни миллионов раз, что позволяет непосредственно определить генотип человека по конкретному локусу, например при помощи электрофореза.

   На Рис. 1А показана динамика относительного использования различных систем генетических маркеров для установления родства в США с 1990г. по 2004 г. по данным Американской ассоциации банков крови (AABB). Как видно из рисунка, к 2004 году почти 100% анализов проводилось методом ПЦР с использованием аутосомных маркеров.

Рис. 1А. Доля использования различных систем генетических маркеров  при проведении исследований по установлению родства в США.

 

Преимущества использования STR-локусов

   В настоящее время для установления биологического родства почти повсеместно используются так называемые STR-локусы. Аббревиатура STR происходит от английского словосочетания Short Tandem Repeat – дословно: короткий тандемный повтор. Локусы данного типа представляют собой цепочки, состоящие из небольших, длиной 2-5 нуклеотидов, одинаковых последовательностей (мономеров) или «повторов». Аллели данных локусов различаются между собой количеством этих повторов. STR-локусы имеют следующие преимущества:

  • большое количество аллелей, что способствует снижению вероятности случайных совпадений.
  • большое количество известных STR-локусов и их относительно равномерное распределение по всем хромосомам человека.
  • возможность с помощью современных методов проводить быстрое и точное типирование образцов по данным локусам.

Методы типирования STR-локусов

Получение генотипов исследуемых лиц осуществляется следующим образом:

  1. Проводится забор биологического материала и выделение ДНК исследуемых лиц.
  2. При помощи локус-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводится искусственное увеличение копий аллелей анализируемых локусов в сотни миллионов раз (амплификация аллелей).
  3. Для разделения и идентификации аллелей проводится совместный электрофорез в полиакриламидном или агарозном геле продуктов амплификации и смеси различных молекул ДНК известной длины, выступающей в качестве стандарта при определении размеров амплифицированных аллелей (так называемый «аллельный леддер»). При электрофорезе короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные, в результате чего происходит разделение аллелей. После проведения электрофореза гель окрашивают, и различные аллели проявляются в виде различных полос на геле. Наличие одной полосы говорит о том, что лицо является гомозиготой по данному локусу, наличие двух полос соответствует гетерозиготе. Сравнивая расположение полос, соответствующих аллелям, с расположением полос в дорожке аллельного леддера, соответствующих молекулам ДНК известного размера, выясняют длину каждого аллеля данного локуса, то есть генотип по данному локусу.

   На Рис. 2 показан фрагмент электрофореграммы амплифицированных аллелей двух локусов лиц, участвующих в анализе на установление отцовства (AF – предполагаемый отец, C – ребенок, M – мать) и двух аллельных леддеров (дорожки L1 и L2). Отрезками красного цвета на рисунке соединены полосы, соответствующие фрагментам молекул ДНК одинаковой

    Из рисунка 2 видно, что в локусе, данные о котором расположены в верхней части электрофореграммы, один из аллелей в генотипе ребенка (161 пара нуклеотидов (п.н.)) совпадает с одним из аллелей в генотипе матери, а другой (149 п.н.) с одним из аллелей в генотипе предполагаемого отца. Во втором локусе аллель размером 108 п.н. совпадает с одним из аллелей в генотипе матери, а аллель размером 98 п.н. совпадает с одним из аллелей в генотипе предполагаемого отца. Как видим, генотипы ребенка, матери и предполагаемого отца по двум рассмотренным локусам удовлетворяют описанным выше правилам совпадения аллелей для родственников, то есть свидетельствуют в пользу истинного отцовства предполагаемого отца в отношении ребенка.

   В настоящее время разработаны и являются общедоступными специальные коммерческие наборы реактивов, предназначенные для амплификации аллелей стандартных STR-локусов (см. системы STR-локусов аутосом и системы STR-локусов Y-хромосомы). Данные наборы предназначены для использования совместно с существующими аппаратно-программными комплексами, с помощью которых осуществляется автоматическое разделение и идентификация аллелей.
   На Рис. 3 показан пример представления результатов типирования исследуемых лиц аппаратно-программным комплексом 3130 Genetic Analyzer, выпускаемым фирмой Applied Biosystems, для трех STR-локусов (D3S1358, TH01, D21S11). В верхнем ряду данных в виде пиков представлена панель аллельных леддеров трех локусов с указанием аллелей, соответствующих каждому пику. Во втором, третьем и четвертом рядах показаны результаты разделения и идентификации аллелей по исследуемым локусам для предполагаемого отца, матери и ребенка соответственно. Например, для локуса D3S1358 получены следующие генотипы: предполагаемый отец – (15,18), мать – (14,18), ребенок – (18,18). Числовые обозначения аллелей соответствуют количеству содержащихся в них повторов.